細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的基本特征，在機(jī)體的胚胎發(fā)育、組織修復(fù)、內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定等方面都起到十分重要的作用。

在正常的活細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸（phosphotidylserine，PS）位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在早期凋亡的細(xì)胞中，PS 從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。Annexin-Ⅴ（膜聯(lián)蛋白-V）是一種分子量為35-36 kDa的Ca2+ 依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力結(jié)合，可通過(guò)細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合。

碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）用來(lái)區(qū)分存活的早期細(xì)胞和壞死或晚期凋亡細(xì)胞。PI是一種核酸染料，它不能透過(guò)正常細(xì)胞或早期凋亡細(xì)胞的完整的細(xì)胞膜，但可以透過(guò)凋亡晚期和壞死細(xì)胞的細(xì)胞膜而使細(xì)胞核染紅。因此，將Annexin V與PI聯(lián)合使用時(shí)，PI 則被排除在活細(xì)胞（Annexin V-/PI-）和早期凋亡細(xì)胞（Annexin V+/PI-）之外，而晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞同時(shí)被FITC 和PI 結(jié)合染色呈現(xiàn)雙陽(yáng)性（Annexin V+/PI+）。

實(shí)驗(yàn)方法

Step1：細(xì)胞培養(yǎng)

Step2：轉(zhuǎn)染或藥物處理

Step3：細(xì)胞收集

Step4：加凋亡試劑

Step5：上機(jī)檢測(cè)

案例展示

技術(shù)總結(jié)

1、考慮到進(jìn)行流式時(shí)需要用到對(duì)照組細(xì)胞設(shè)置空白組（用于調(diào)節(jié)電壓）和單染組細(xì)胞（用于調(diào)節(jié)補(bǔ)償），因此要求該組細(xì)胞量較其他組多

2、如發(fā)現(xiàn)細(xì)胞密度偏低，細(xì)胞量較少，則適當(dāng)增加離心時(shí)間。收集細(xì)胞時(shí)，應(yīng)該連同上清一起收集，同時(shí)胰酶消化時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，否則容易引起假陽(yáng)性

3、檢測(cè)細(xì)胞經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)染等處理后可能會(huì)帶有自發(fā)熒光，應(yīng)注意選擇凋亡試劑盒的顏色通道 如：帶綠色熒光時(shí)，應(yīng)選擇7AAD試劑盒

4、細(xì)胞鋪板應(yīng)選擇細(xì)胞狀態(tài)良好的時(shí)候進(jìn)行，且避免反復(fù)吹打

5、流式檢測(cè)細(xì)胞樣本：細(xì)胞樣品準(zhǔn)備時(shí)，使用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞，不得使用細(xì)胞刮刀進(jìn)行操作，胰酶消化細(xì)胞時(shí)切忌消化過(guò)頭或沒(méi)有打開細(xì)胞間隙