迄今為止，文獻報道的許多類器官都是在Matrigel中培養(yǎng)的。Matrigel來源于Engelbreth Holm-Swarm小鼠肉瘤細胞的分泌物，制備工藝簡單，成本低廉，在3D細胞培養(yǎng)中得到了廣泛的應用。而蛋白質(zhì)組學結(jié)果表明，Matrigel含有1800多種蛋白質(zhì)，——由此可以看出，Matrigel成分復雜，這大大加劇了類器官結(jié)構(gòu)和功能研究的難度。此外，Matrigel的批次不穩(wěn)定也使類器官實驗結(jié)果的重復性大打折扣。與此同時，出于免疫原性的考慮，動物來源的Matrigel在疾病建模和臨床研究中的應用也受到了限制?；谏鲜鲈颍瑢饶軡M足類器官培養(yǎng)要求、又能滿足臨床研究要求的新型基質(zhì)的需求越來越多。而無異源基質(zhì)膠正是滿足這些要求的理想選擇。

無異源基質(zhì)膠是由溶解的人源組織制備的細胞外基質(zhì)水凝膠（ECM）。在制備過程中，保留了天然組織的部分生物學活性，促進了其中培養(yǎng)的類器官的結(jié)構(gòu)和功能重塑。此外，這類水凝膠保留了細胞外微環(huán)境的組織特異性，相比Matrigel，可以更好支持各種組織來源細胞的生長；其源于人源組織的特性，也大大減少了臨床應用中的免疫原性問題。無異源基質(zhì)膠的這些優(yōu)點，使其具有重要的臨床應用優(yōu)勢，進而大大推動再生醫(yī)學技術(shù)和組織工程的進步。

人源ECM的凝膠化和表征

首先驗證HumaMatrix（一種源自人源的細胞外基質(zhì)）在遵循凝膠化方案時可以成功地制備成水凝膠，首先用HCl 溶液溶解HumaMatrix粉末，用NaOH調(diào)節(jié)pH 至中性，靜置到接近生理溫度。實驗組的人源 ECM 水凝膠在不同濃度（3、4、5、6、7 和 8 mg/mL）下都制備成水凝膠；用三個批次的HumaMatrix在8 mg/mL的濃度下，約 30 分鐘都制備成水凝膠。

圖1. 不同濃度的人源ECM形成水凝膠

其次，去細胞化和凝膠化的處理方法，有效保留了人源ECM成分，如膠原蛋白、彈性蛋白，且仍含有糖胺聚糖。與傳統(tǒng)3D培養(yǎng)系統(tǒng)（例如Matrigel）相比，人源ECM基質(zhì)膠所含成份和三維結(jié)構(gòu)明顯不同。為進一步研究HumaMatrix的結(jié)構(gòu)，進行掃描電鏡分析。

圖2. 顯示HumaMatrix的掃描電鏡 (SEM) 圖像

人源ECM對血管生成的影響

血管生成的測定。根據(jù)體外血管生成測定的歷史金標準方法，我們比較了分別用Matrigel和hPM（一種源自胎盤的人類細胞外基質(zhì)）誘導的微血管網(wǎng)絡(luò)（圖 3C）。首先將EC培養(yǎng)物用Matrigel或hPM來培養(yǎng)，然后使用Calcein AM檢測以確定活性和網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。培養(yǎng)1天后，Matrigel包被的孔板上顯示HUVEC形成明確的血管生成小管網(wǎng)絡(luò)，但在 3 天后，相同的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)塌陷成凋亡細胞的球形球（圖3A、3C）。雖然在hPM誘導的網(wǎng)絡(luò)中出現(xiàn)一些細胞死亡，且在延長培養(yǎng)5天后沒有觀察到細胞凋亡現(xiàn)象。在血管生成的晚期，EC募集平滑肌細胞 (SMC) 以穩(wěn)定生長的微血管。按照同樣的方法評估了hPM和Matrigel對平滑肌細胞形態(tài)的影響。有趣的是，在沒有HUVEC的情況下，接種到Matrigel上的SMC在1天后形成小管，但在hPM涂層板上，SMC保持典型的“山丘和山谷"形狀（圖 3D），表明細胞類型之間的分子信號通路存在顯著差異 【1】 。

圖3. 在hPM 和 Matrigel 包被的組織培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的體外血管生成網(wǎng)絡(luò)【1】

人源ECM支持hiPSC三系分化

hiPSCs 來源于多種類型的人原代細胞，包括新生兒包皮成纖維細胞、成人真皮成纖維細胞和成人成骨細胞。在多譜系分化之前，使用Tra-1-81對未分化的人多能干細胞進行ICC（圖 4a）。如圖所示，hiPSCs批次顯示Tra-1-81的清晰表達。hiPSC 分為三個階段以分化出目標譜系（圖 4b）。在EB形成期間，hiPSC先轉(zhuǎn)化為特定的譜系；在第二階段，EB在各種基質(zhì)上發(fā)生了附著、生長和成熟；最終，細胞在第三階段成熟和擴增以完成向目標譜系的分化【2】。

圖4. hiPSC 細胞系的表征和分化示意圖【2】

人源ECM用于藥物篩選

hPM除了應用在再生醫(yī)學中，還能用于體外篩選血管生成相關(guān)藥物【1】。同時也測試了HumaMatrix培養(yǎng)的腸癌類器官篩選相關(guān)藥物的能力，Matrigel已被廣泛用作體外篩選抗血管生成癌癥藥物的模型和癌癥類器官模型，因此用Matrigel作為對照。圖5通過比較用TSP-1處理的Matrigel或hPM培養(yǎng)的EC（內(nèi)皮細胞）生長情況來評估藥物對血管生成的抑制作用。其中，TSP-1是一種對血管生成和新血管形成有抑制活性的糖蛋白，是實體瘤抗血管生成治療的常規(guī)用藥【1】。我們設(shè)計類似實驗檢測HumaMatrix培養(yǎng)的腸癌類器官在藥物篩選中的表現(xiàn)。通過比較Matrigel或HumaMatrix培養(yǎng)的腸癌類器官經(jīng)過不同濃度的Regorafenib處理后的生長狀況，評估類器官對不同藥物的敏感性（如圖6）。

圖5. 使用基于hPM的血管生成實驗來篩選抗血管生成腫瘤抑制蛋白TSP-1【1】

圖6. 使用不同濃度的Regorafenib處理腸癌類器官來檢測類器官對藥物的敏感性。

人源ECM的組織相容性

當皮下注射到SD大鼠體內(nèi)，在生理pH條件下，hPM就會形成水凝膠。注射后20分鐘內(nèi)，在注射位點皮膚下方會出現(xiàn)一個腫塊。注射hPM的SD大鼠沒有出現(xiàn)嚴重的炎癥反應，例如紅斑腫脹和積液。注射后1周對植入物的組織學評估顯示，在所有注射hPM的動物中，細胞浸潤反應增加。同時，觀察到輕微的單核細胞浸潤反應，主要表明淋巴細胞和巨噬細胞的參與（圖7A-F）。此外，還觀察到梭形細胞，這說明可能有成纖維細胞浸潤。H&E染色顯示皮下植入物周圍的炎癥反應消退，4周后未發(fā)生肉芽腫，表明所有水凝膠均未引起明顯的局部毒性，并顯示出良好的組織相容性【3】。

圖7. HE染色顯示，在大鼠皮下植入后 1、2 和 4 周，組織對hPM (A-C) 和膠原蛋白I水凝膠(D-F) 的反應的組織學表現(xiàn)。比例尺=200 μm【3】

總結(jié)

小鼠腫瘤細胞衍生的 Matrigel方便購買且易于使用，支持類器官生長和擴增。然而，Matrigel的來源限制了類器官在細胞治療或組織工程應用中的直接臨床轉(zhuǎn)化。顯然需要一種根據(jù)GMP指南生產(chǎn)的水凝膠替代品。這種替代方案還必須保證類器官的培養(yǎng)和大規(guī)模擴增。相關(guān)數(shù)據(jù)表明，人源ECM水凝膠是用于大規(guī)模培養(yǎng)類器官的潛在選擇，可能釋放類器官的巨大臨床潛力，推動臨床研究中血管生成技術(shù)的進步。

參考文獻

1. M. C. Moore, V.Pandolfi and P. S. McFetridge. Novel human-derived extracellular matrix inducesin vitro and in vivo vascularization and inhibits fibrosis. Biomaterials. 2015May ; 49: 37–46. doi:10.1016/j.biomaterials.2015.01.022.

2. A. C.Murchison, J. J. Odanga, M. L. Treadwell, E. K. Breathwaite, J. R. Weaver andJ. B. Lee, Int. J. Stem Cells, 2020, 13, 432–438

3. Ning-NingChao,?a,b Jia-Le Li,?a Wei Ding,a Ting-Wu Qin,a Yi Zhang,a Hui-Qi Xiea andJing-Cong Luo. Biomater. Sci., 2022, 10, 2062.

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