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EZ細(xì)胞及動(dòng)物組織RNA直擴(kuò)RT-PCR試劑盒（步法） 不需提取細(xì)胞RNA，經(jīng)過(guò)30分鐘簡(jiǎn)單處理后，直接進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。可用于細(xì)胞基因的克隆、基因表達(dá)定量、RNA病毒基因的擴(kuò)增、RNA病毒PCR診斷、RNA病毒Real-time PCR診斷等。

產(chǎn)品資料

產(chǎn)品名稱(chēng)：EZ細(xì)胞及動(dòng)物組織RNA直擴(kuò)RT-PCR試劑盒（步法）

英文名稱(chēng)：EZ Cell and Tissue RNA Direct PCR Kit（One Step)

產(chǎn)品規(guī)格：30T/100T

試劑盒應(yīng)用：細(xì)胞組織或細(xì)胞基因的擴(kuò)增與克隆、RNA病毒基因的擴(kuò)增、RNA病毒PCR診斷、RNA病毒Real-time PCR.。

試劑盒組成：RNA-EZ-1、RNA-EZ-2、RNA-EZ-3、RNA-EZ-4、RT-Enzyme、2*RT-Buffer、ddH2O

保存條件：-20oC保存。使用將RNA-EZ-1、RNA-EZ-4在室溫或37oC充分溶解。RNA-EZ-3、RNA-EZ-4和RT-Enzyme使用時(shí)需置于冰上。

使用方法：

細(xì)胞中RNA的擴(kuò)增

（1）將6ul RNA-EZ-1與3ul RNA-EZ-2充分融合。

（2）取20ul細(xì)胞懸液（10^5-10^6cells/ml）,加入上述混合液，混勻。

（3）置于37oC靜置10分鐘。

（4）加入1ul RNA-EZ-3，混勻。

（5）置于37oC靜置15分鐘。

（6）置于98oC加熱5分鐘。

（7）加入60ul的RNA-EZ-4，混勻。

（8）取2ul（7）中處理液進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。

組織塊中RNA的擴(kuò)增

（1）用 H2O 將 RNA-EZ-1 稀釋 5 倍，每 25 μL 的 RNA-EZ-1 稀釋液中加入 3 μL 的 RNA-EZ-2，混合均勻。同時(shí)處理多個(gè)組織塊時(shí)，可以按照以上比例配制預(yù)混液并分裝到每個(gè)離心管 26 µL。

（2）切取半顆米粒大小的組織塊（< 3 mm3），*浸入上述混合液中。

（3）置于 37oC 靜置 10 分鐘。

（4）加入 1µL RNA-EZ-3，混勻。

（5）置于 37oC 靜置 15 分鐘。

（6）置于 98oC 加熱 5 分鐘。

（7）加入 60 μL RNA-EZ-4，混勻。

（8）取 2 μL（7）中處理液進(jìn)行 RT-PCR 擴(kuò)增。

Real-Time PCR

取上述細(xì)胞或組織處理液，加入特異性引物和 TaqMan 探針，可進(jìn)行特異性靶標(biāo) RNA 的絕對(duì)定

量檢測(cè)。如需進(jìn)行 SYBR Green Real-time PCR，請(qǐng)選擇 EZ021-01/-02（EZ® Cell and Tissue RNA Direct

PCR Kit（One Step)）。

注意事項(xiàng)

（1）取樣的細(xì)胞量應(yīng)當(dāng)適中，濃度不宜過(guò)高或過(guò)低，處理后溶液應(yīng)當(dāng)以透明為宜。

（2） 樣品處理過(guò)程中應(yīng)當(dāng)防止交叉污染，推薦設(shè)置陰性對(duì)照參與處理過(guò)程，以檢測(cè)環(huán)境的污染。

（3）用本產(chǎn)品擴(kuò)增的 RNA 不宜太長(zhǎng)，1000bp 及以?xún)?nèi)的片段佳，期研究中可擴(kuò)增長(zhǎng)達(dá) 1800bp的片段，擴(kuò)增片段越長(zhǎng)效率越低。擴(kuò)增的成功率也與 RNA 的豐度、二結(jié)構(gòu)以及引物等有關(guān)。

（4）本產(chǎn)品同樣適用于相應(yīng)的細(xì)胞或組織中 RNA 病毒的 PCR、Real-Time PCR 診斷。

（5）2×RT-Buffer 中加入了染料和相應(yīng)試劑，可直接進(jìn)行電泳，無(wú)需另加 Loading buffer。

（6）處理 96 孔板中的細(xì)胞時(shí)，可按照 ddH2O:RNA-EZ-1:RNA-EZ-2=20:5:3 的比例配制預(yù)混液，使用多道移液器直接加入 96 孔板經(jīng) DPBS 洗滌的細(xì)胞中，實(shí)現(xiàn)高通量操作。

（7）2×RT-Buffer 中的染料不影響 TaqMan 探針的效果。

某皰疹病毒的Taqman探針?lè)ǘ繖z測(cè)。將病毒進(jìn)行連續(xù)10倍稀釋?zhuān)肊Z010試劑盒處理后，加入特異性Taqman探針，進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，檢測(cè)曲線呈現(xiàn)明顯的梯度關(guān)系，樣品間重復(fù)性良好，Ct值線性模擬R2=0.9978

某皰疹病毒的Taqman探針?lè)ǘ繖z測(cè)。將病毒進(jìn)行連續(xù)10倍稀釋?zhuān)肊Z010試劑盒處理后，加入特異性Taqman探針，進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，檢測(cè)曲線呈現(xiàn)明顯的梯度關(guān)系，樣品間重復(fù)性良好，Ct值線性模擬R2=0.9978